MSC无血清CD完全培养基（外泌体专用）不含酚红

产品优势

化学成分完全明确 ，2-8℃避光保存 ，无须干冰运送；

不含异源动物源组分，不含人血清，且不含血替（血小板裂解物 、AB 血浆等）成分；

即用型产品 ，无需任何添加剂且无需贴壁包被；

安全性上有效避免了人 、动物等原料带来的病原体污染 ，从根源上解决了核酸病毒 、朊病毒和未知传染性疾病带来的风险问题；

培养基外泌体含量极低，适用于间充质干细胞分泌的外泌体的收集及下游应用；

本产品使用注射用水配制 ，且经过 0.1μm 滤膜过滤，无不溶性颗粒；

产品信息

使用说明

原代细胞培养（组织块贴壁法）

1. 将脐带、羊膜等来源的组织块去除血液 、血管以及上皮等其他杂质后，用 PBS 缓冲液或生理盐水多次清洗。然后用灭菌的剪刀剪成1-3 mm3大小的组织块。

2. 将干细胞CD培养基从 2-8℃取出 ，37℃预温 15～30 分钟。

3.用适量预温后的培养基将组织块重悬，建议添加培养基的量为：每0.5g组织块添加4mL培养基（原代细胞培养过程中建议添加1x 庆大霉素溶液）。

4.用无菌吸管吸取组织块悬液，均匀接种于培养器皿中，37℃、5%CO2条件下静置培养。

48小时内不要对培养器皿进行任何移动（注 ：细胞培养器皿必须是表面处理过的有利于细胞贴壁生长的器皿）。

5. 补液：48小时后进行半量补液或半量更换新鲜的培养基。以后每两天更换一次培养基 ,当组织块周围细胞密度高时，可以人为将组织块剥离，这个组织块就会在其他区域继续生长细胞。一般原代细胞在第6-9天开始爬出生长，培养10-14 天收获原代细胞，具体根据细胞密度情况而定。

6. 消化：使用温和型重组消化酶消化原代细胞，建议控制消化时间且不可消化过度。加入消化液 2 倍体积的细胞上清或者加入胰蛋白酶抑制剂溶液来终止消化，1500rpm,离心3分钟，弃上清，收获P0代原代细胞。

原代细胞培养（酶解消化法）

1.该部分以单细胞悬液开始。单细胞悬液的获取方式包括但不限于使用胰酶、胶原酶、分散酶等消化法从脐带、羊膜、脂肪等组织获得；使用离心法直接从羊水、全血、骨髓获得。

2. 将该培养基从2-8℃取出 ，37℃预温 15～30 分钟。

3. 原代接种 ：以上方法获得的细胞，经 70um 的细胞筛过滤之后，1500rpm 离心5 分钟收集细胞沉淀，加入适量预温的培养基，充分混匀，吹散细胞沉淀。按照一定的细胞密度接种至培养器皿中。37℃ ,5%CO2条件下静置培养。48 小时内不要对培养器皿进行任何移动（注：细胞培养器皿必须是表面处理过的有利于细胞贴壁生长的器皿）。

4. 补液 ：48小时后进行半量补液或半量更换新鲜的培养基。 以后每两天更换一次培养基, 观察细胞的生长状态。消化法细胞在第2-5 天开始贴壁生长，培养 7-10 天收获原代细胞，具体根据细胞密度情况而定。

5. 消化收获原代P0细胞 。方法同上。

细胞传代培养（非原代）

1.在显微镜下观察细胞， 当细胞融合度达到90%左右 ，即可进行传代。

2.吸出细胞培养上清 ，加入 PBS（无 Ca2+ 、Mg2+ ）溶液清洗一次，加入适量的温和型重组消化酶，使其完全覆盖培养皿底部。

3. 室温孵育或37℃消化 ，观察大部分细胞从培养皿底部脱落后立即停止消化。

4. 加入消化液 2倍体积的细胞上清或胰蛋白酶抑制剂溶液 ，用移液器轻轻吹打，使细胞全部从培养皿脱落并形成单细胞悬液。

5. 1500rpm，离心 3 分钟 ，弃上清，加入干细胞 CD 培养基重悬细胞， 进行细胞计数。

6. 按照 8000-10000 cells/cm2 的密度进行传代接种，置于 37℃ ,5%CO2条件下静置培养。培养 60-72 小时之内收获细胞（可调整细胞种植密度，使传代天数在 3 天左右，期间不需要更换新鲜培养基）。

细胞复苏

1.从液氮中取出冻存的细胞，迅速放入复苏装置或 37℃水浴快速融化。

2.将解冻后的细胞悬液中缓慢加入 5-10 倍冻存体积的干细胞 CD培养基，混匀，1500rpm，离心3 分钟 ，弃上清，加入适量的干细胞 CD培养基重悬细胞沉淀。

3.进行细胞计数，然后按照按照 8000 -10000cells/cm2的密度进行传代接种，置于 37℃ , 5%CO2条件下静置培养。培养 60-72 小时之内收获细胞（可调整细胞种植密度，使传代天数在 3 天左右，期间不需要更换新鲜培养基）。

细胞冻存

1.在显微镜下观察细胞， 当细胞融合度达到90%左右 ，即可进行冻存。

2. 吸出细胞培养上清，加入 PBS（无 Ca2+ 、Mg2+ ）溶液清洗一次，加入适量的温和型重组消化酶，使其完全覆盖培养皿底部。

3. 室温孵育或37℃消化，观察大部分细胞从培养皿底部脱落后立即停止消化。加入消化液2 倍体积的细胞上清或胰蛋白酶抑制剂溶液，用移液器轻轻吹打，使细胞全部从培养皿脱落并形成单细胞悬液。

4.1500rpm，离心3分钟，弃上清，加入适量干细胞 CD培养基重悬细胞，进行细胞计数。

5. 按照0.5-1X107个细胞/mL 的密度加入无血清细胞冻存液，充分混匀，直接放入-80℃ 冰箱中保存过夜， 之后长期保存可置于液氮中 。 （若使用冻存袋冻存 ，可根据需要选择冻存方案）

特别提示

以上所有操作均在无菌细胞培养室进行 ，细胞开放操作要在生物安全柜内进行；

培养器皿包括培养皿 、培养瓶 、细胞工厂以及 3D 微球等，请根据实验需要自行选择；

无血清CD培养基缺少胰酶的抑制剂 ，建议选用胰蛋白酶抑制剂来终止消化；

间充质干细胞切忌生长过满以及消化过度，会导致细胞快速老化。