MSC无血清化学成分限定培养基（含酚红）

产品优势

化学成分完全明确，2-8℃避光保存，无须干冰运送；

不含异源动物源组分，不含人血清，且不含血替（血小板裂解物、AB血浆等）成分；

即用型产品，无需任何添加剂且无需贴壁包被；

安全性上有效避免了人、动物等原料带来的病原体污染，从根源上解决了核酸病毒、朊病毒和未知传染性疾病带来的风险问题；

培养基外泌体含量极低，属于无外泌体培养基，适用于间充质干细胞分泌的外泌体的收集及下游应用；

本产品使用注射用水配制，且经过0.1μm滤膜过滤，无不溶性颗粒；

产品信息

使用说明

原代细胞培养（组织块贴壁法）：

1. 将脐带、羊膜等来源的组织块去除血液、血管以及上皮等其他杂质后，用PBS缓冲液或生理盐水多次清洗。然后用灭菌的剪刀剪成1-3 mm3大小的组织块。

2. 将间充质干细胞无血清化学成分限定CD培养基从2-8℃取出，室温预温15～30分钟。

3. 用适量预温后的培养基将组织块重悬，建议添加培养基的量为：每0.5g组织块添加6 -8mL培养基（原代细胞培养过程中建议添加1x庆大霉素溶液）。

4. 用无菌吸管吸取组织块悬液，均匀接种于培养器皿中，37℃，5%CO2条件下静置培养。48小时内不要对培养器皿进行任何移动（注：细胞培养器皿必须是表面处理过的有利于细胞贴壁生长的器皿）。

5. 补液：48小时后进行半量补新鲜的培养基。以后每两天更换一次新鲜的培养基。当组织块周围细胞密度高时，可以人为将组织块剥离，这个组织块就会在其他区域继续生长细胞。一般原代细胞在第6-9天开始爬出生长，培养10-14天收获原代细胞，如果爬出时间较晚，请延长培养及收获时间至16-18天，具体根据细胞密度情况而定。

6. 消化：使用重组胰蛋白酶消化液消化原代细胞，室温孵育或37℃消化3-5分钟，观察大部分细胞从培养皿底部脱落后立即停止消化。（注：千万不要消化时间过长，消化3-5分钟后，可用手轻轻拍打培养皿底部，或终止消化之后用移液器轻轻吹打几次，使细胞完全脱落。）加入细胞培养基原液来终止消化，添加体积与重组胰蛋白酶消化液的体积比例为3:1，1500rpm, 离心3分钟，弃上清，收获P0代原代细胞。

原代细胞培养（酶解消化法）：

1. 该部分以单细胞悬液开始。单细胞悬液的获取方式包括但不限于使用胰酶、胶原酶、分散酶等消化法从脐带、羊膜、脂肪等组织获得；使用离心法直接从羊水、全血、骨髓获得。

2. 将该培养基从2-8℃取出，室温预温15～30分钟。

3. 原代接种：以上方法获得的细胞，经70μm的细胞筛过滤之后，1500rpm离心3分钟收集细胞沉淀，用PBS缓冲液清洗细胞沉淀2-3次，以去除消化酶的残留，避免细胞消化过度。然后加入适量预温的培养基，充分混匀，吹散细胞沉淀。按照一定的细胞密度（建议10000-50000个/cm2，此时的细胞并不是单一纯净细胞，所以接种密度可以大一些）接种至培养器皿中。37℃，5%CO2条件下静置培养。48小时内不要对培养器皿进行任何移动（注：细胞培养器皿必须是表面处理过的有利于细胞贴壁生长的器皿）。

4. 补液：48小时后进行半量补新鲜的培养基。以后每两天更换一次新鲜培养基，观察细胞的生长状态。消化法细胞在第2-5天开始贴壁生长，培养7-10天收获原代细胞，具体根据细胞生长密度情况而定。

5. 消化收获原代P0细胞。方法同上。

细胞扩增培养

1. 首先进行细胞计数以及确定细胞活率（注：复苏时需确保细胞活率至少在90%以上，最好在95%以上，这样才可以保证复苏后的细胞生长状态）。如间充质干细胞种子是用含血替或血清的培养基扩增的，可以直接替换成无血清化学成分限定CD培养基，无须驯化。但是需要在细胞传代接种之前，用PBS缓冲液将细胞沉淀清洗2-3次，彻底去除血替或血清残留，否则会影响后续细胞的生长。

2. 按照8000-10000 cells/cm2的活细胞密度进行接种，添加适量体积的培养基（具体添加体积见下表），混合均匀之后，置于37℃，5%CO2条件下静置培养。注意：培养基添加量应大于0.3ml/cm2培养皿的底表面积。

3. 在显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到80-90%左右，即可进行传代。一般为2-3天（约为60h-72h）左右。不同hMSC的生长速度有差异，尤其是第一次使用本公司这款产品时，需要每天观察记录一下细胞状态和细胞密度，以掌握培养基的性能，推荐以细胞汇合度（85%-90%为佳）选择准确传代时机，细胞汇合度过高（>95%）会影响后续细胞的生长，加速细胞的衰老或停滞生长。

4. 吸出细胞培养上清，加入PBS（无Ca2+、Mg2+）溶液清洗1-2次，加入适量的重组胰蛋白酶消化液（推荐本公司Cat No. JXS0106），使其完全覆盖培养皿底部。

5. 室温孵育或37℃消化3-5分钟，观察大部分细胞从培养皿底部脱落后立即停止消化。（注：千万不要消化时间过长，消化3-5分钟后，可用手轻轻拍打培养皿底部，或终止消化之后用移液器轻轻吹打几次，使细胞完全脱落。）

6. 加入细胞培养液上清来终止消化，添加体积与重组胰蛋白酶消化液的体积比例为3:1，转速1500rpm, 离心3分钟，弃上清，收获细胞沉淀。

7. 加入适量干细胞无血清CD培养基重悬细胞沉淀，用移液器轻轻吹打吹散，进行细胞计数以及确定细胞活率。

8. 继续按照步骤1进行下一代的传代接种，或进行细胞冻存操作，冻存事宜请参考无血清细胞冻存液的操作规程。

细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存的细胞，迅速放入复苏装置或37℃水浴快速融化。

2. 将解冻后的细胞悬液中缓慢加入5-10倍冻存体积的间充质干细胞无血清化学成分限定CD培养基，混匀，转速1500rpm，离心3分钟，弃上清，再次加入适量的间充质干细胞无血清化学成分限定CD培养基重悬细胞沉淀。

3. 进行细胞计数以及确定细胞活率（注：复苏时需确保细胞活率至少在90%以上，最好在95%以上，这样才可以保证复苏后的细胞生长状态），然后按照8000-10000 cells/cm2 的活细胞密度进行复苏接种，置于37℃，5%CO2条件下静置培养。

细胞形态图：

下图为显微镜（100X）倍数下的拍摄图片

特别提示：

以上所有操作均在无菌细胞培养室进行，细胞开放操作要在生物安全柜内进行；

培养器皿包括培养皿、培养瓶、细胞工厂以及3D微球等，请根据实验需要自行选择，且所有的器皿均应进行过TC表面处理，有利于细胞贴壁生长；

间充质干细胞无血清化学成分限定CD培养基缺少胰酶的天然抑制剂，建议通过快速多次PBS清洗，以彻底去除残留的重组胰蛋白酶对细胞继续进行消化，以致消化过度导致衰老；

间充质干细胞切忌生长过满（>95%）以及消化过度(消化时间过长或残留胰蛋白酶继续消化细胞等)，会导致细胞快速老化或停滞生长。

本产品细胞的生长曲线扩增效率高，不能直接按照常规4天收获细胞来进行操作，我们建议的细胞培养时间为60小时左右，最晚不超过72小时。建议48小时之后一定要进行细胞状态观察，来决定细胞的收获时间。

如复苏之前的间充质干细胞是用含血替的培养基扩增的，可以经过多次PBS清洗之后替换成间充质干细胞无血清化学成分限定CD培养基，无须驯化。切记：用PBS缓冲液将细胞沉淀清洗2-3次，彻底去除血替或血清残留，否则会影响后续细胞的生长。

建议按照该说明书的接种密度进行细胞接种。细胞密度太低，细胞前期扩增速度缓慢，且状态不如预期细胞生长状态。细胞密度过高，培养时间会缩短，培养基营养容易耗尽，易产生细胞接触抑制，促进细胞分化与衰老。