Stem 8 多能干细胞培养基是一款无血清，化学成分明确的多能干细胞（PSC）培养基，可用于人胚胎干细胞（hESC）或人诱导型多能干细胞（hiPSC）在无小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）支持的情况下的培养。相比于目前市面上其它的 PSC 培养基，除了能够满足多能干细胞的快速增殖和干性的维持之外 ，Stem 8 多能干细胞培养基在各培养体系的转换中展示出优秀的适应性，大大缩短了其它体系下培养的 PSC 的驯化周期。
品名 | 货号 | 规格 | 储存条件 | 保质期 |
Stem 8 多能干细胞培养基 | JXM0909-A | 490 ml | 2~~8 , 避光保存 |
12 个月 |
Stem 8 添加剂 | JXM0909-B | 10ml | -20℃ , 避光保存 |
若无特别说明，本文中的所有材料均在室温下使用。
若无特别说明，本文中的所有离心条件均为 200g 下离心 3 分钟。
所有操作均应在满足多能干细胞培养条件的细胞培养间和操作台内进行。操作人员应接受完整的无菌操作培训，并对多能干细胞培养有一定经验。
1. 1 . 1 将 Stem 8 添加剂静置于室温解冻（通常仅需不超过 30 分钟） ， 或提前一天取出
置于 2℃-8℃条件下解冻。
- 切勿将添加剂置于 37℃水浴锅中加热。
1. 1.2 用无菌移液管将 10ml 添加剂转移至 500ml Stem 8 基础培养基培养瓶中，并吸取约 10ml 培养基将盛装 Stem 8 添加剂的容器内表面润洗一次，加入 Stem 8 基础培养基培养瓶中混合均匀，成为 Stem 8 完全培养基（以下简称S8 完全培养基）。
1. 1.3 S8 完全培养基可在 2℃-8℃避光条件下保存 1 月，使用前将完全培养基预热至室温。对于平时用量有限的实验室，推荐将 S8 完全培养基分装至 50ml 无菌离心管中，使用前仅预热当天所需的量。
-室温条件下通常预热 30 分钟即可。切勿将 S8完全培养基置于 37℃水浴锅中加热。
本操作以 Matrigel 为包被材料进行说明 ，使用其它包被材料（如 Geltrex 、Cultrex 、 Vitronectin 、Laminin 等） 时具体的消化时间、接种密度会有区别，请参考所选用材料的官方说明书进行使用。Matrigel 存在批次间差异，分装前需要注意该批次的具体浓度与分装建议。日常使用中，建议将 Matrigel 分装为一次足够包被三个六孔板（ 18 个孔） 的量并于-80 进行保存，化冻、分装与运输过程中务必确保 Matrigel 温度不升高至 10℃以上（否则 Matrigel会迅速凝结） ，建议使用隔夜化冻、冰盒、提前一小时在-20℃预冷枪头和 0. 6ml 分装管等手段来确保其维持低温状态。
1.2. 1 将分装好的 Matrigel 从-80℃冰箱取出，置于冰盒之上，在 2-8℃冰箱内解冻。
1.2 .2 使用移液管将 18ml DMEM/F-12(Gibco 11330 ，含15mM HEPES)转移至 50ml 离心管内，在加入 Matrigel 之前保持在冰上，或置于 2-8℃内保持低温状态。
1.2.3 待 Matrigel 完全解冻后，将冰盒转移至操作台内， 使用200ul 枪头将50ml 离心管内预冷的DMEM/F-12 吹打2-3 次以降低枪头温度，然后将 Matrigel 全部吸取并加入预冷的18ml DMEM/ F-12 中，混合均匀，2 周内使用。
-可以使用移液管吹打或直接摇晃离心管将 Matrigel 稀释液混合均匀，但最好避免产生泡沫。如果不着急， 可将稀释后的Matrigel 稀释液置于2-8℃冰箱一小时后再使用。
1.2.4 以 0.1ml/cm2 的用量（ 1ml/六孔板1 孔）将 Matrigel 稀释液加入 TC 处理的培养容器中，晃动容器使其覆盖全部表面，置于 37℃培养箱中包被一小时以上。
-使用 Matrigel 稀释液时，应将其全程放置于冰盒上，或仅手持50ml 离心管上半部分并在使用完后立刻放回冰箱。
-包被完成的孔板建议当天使用，或使用封口膜密封后置于 2-8℃保存不超过一周。
* 以下 2-4 部分所述操作适用范围均为已经在 S8 培养基中培养驯化的 PSC 。如果是在其它体系中培养的细胞，请先阅读“5. 将其它培养体系下的PSC 细胞转移至Stem 8 体系”。
2.1 S8 复苏/传代培养基配制：室温预热 S8 完全培养基，根据所用的细胞凋亡抑制剂 (如 Y27632 等）推荐浓度配置 S8 复苏/传代培养基。将 9ml S8 完全培养基转移至 15ml离心管中。
-以工作浓度取 5uM 的 y27632 举例，若配置的储存液浓度为 50mM ，使用时将储存液以 1:10000 的比例与 S8 完全培养基混匀，成为 S8 复苏/传代培养基。
2.2 将细胞从液氮罐中取出，置于干冰上，转移至细胞房内。为防止进入冻存管中的液氮快速升温膨胀导致冻存管爆炸，最好等待 3-5 分钟，使可能存在冻存管内的液氮完全蒸发后再进行后续操作。
2.3 吸弃包被完成的六孔板中的 Matrigel ，每孔加入 2ml S8 复苏/传代培养基，放入 37℃培养箱中平衡 pH 。手持冻存管置于 37℃水浴锅中，注意不要使水没过管口，轻轻晃动以加速融化过程。当观察到冻存管内仅剩下小片冰晶时，用 70%酒精喷洒其外侧后转移至操作台内。
-平衡 pH 时长至少 15 分钟，可以略微提升复苏后细胞的状态，但此步骤并非必需。
2.4 用移液器将冻存管内的细胞转移至步骤 2. 1 中准备的离心管中，并用少量 S8 完全培养基润洗冻存管内侧以尽可能多地收集细胞后，离心后吸弃上清，用 1-2ml S8 复苏/传代培养基重悬。
-若细胞是以单细胞形式冻存，这里可以选择计数， 以更精确地控制细胞的接种密度。
2.5 以合适的密度将重悬后的细胞接种至步骤 2.3 准备的六孔板中，在 37℃培养箱中十字法摇晃均匀，24h 后更换为 S8 完全培养基，此后隔天换液直至细胞融合度达到 80-90%。
-刚复苏的细胞推荐以略高于传代时的密度（ 3-5 万/cm2 ，或 30-50 万/孔）进行接种。
-对于以细胞团形态被冻存的细胞，请根据冻存时的细胞状态估算细胞量。
-当观察到细胞融合度大于 50%时，可以在换液时额外加入 1-2ml S8 完全培养基以防止细胞因营养耗尽而死亡。
-如果想要间隔两天换液，可以在换液时加入双倍的 S8 完全培养基，具体操作需要注意的事项在“7.5 周末换液”中说明。
当细胞融合度达到 80-90%时，可以进行传代。将 PSC 消化成单细胞形态进行传代和冻存会对细胞造成较大压力，更容易出现细胞核型异常，长期进行此操作的细胞推荐每 10-15代进行一次核型检测。
3. 1 室温预热 S8 完全培养基、PBS（ 不含钙、镁）、TrypLE Express 消化液和 Matrigel包被的六孔板，并根据所用的细胞凋亡抑制剂推荐浓度配置 YS 8 复苏/传代培养基。将 10ml S8 完全培养基转移至 15ml 离心管中。
3.2 吸弃包被完成的六孔板中的 Matrigel ，每孔加入 2ml S8 复苏/传代培养基，放入37℃培养箱中平衡 pH 和温度。
3.3 从培养箱中取出细胞，吸弃培液。每孔加入 1ml PBS ，轻柔晃动孔板以润洗表面一次，吸弃。每孔加入 1ml TrypLE Express ，置于 37℃培养箱中消化 3-5 分钟。
-不同 PSC 细胞系的贴壁强度存在差别，需要操作人员观察并优化 。使用其它消化液时请参照各自品牌提供的操作说明。
3.4 每孔加入 1ml 步骤 3. 1 准备的离心管中的 S8 完全培养基，用移液器轻柔吹打 3-4次，将所有细胞悬液收集到离心管中，离心后吸弃上清，用 1-2ml S8 复苏/传代培养基重悬后计数。
-每 1ml TrypLE Express 需要至少 5ml 完全培养基稀释来终止消化，在操作多个孔时请按此标准计算所需的培养基量。
3.5 根据后续实验计划，在步骤 3.2 准备的六孔板中每个孔接种 10-30 万细胞，在 37℃培养箱中十字法摇晃均匀，24h 后更换为 S8 完全培养基，此后隔天换液直至细胞融合度达到 80-90% 。不同 PSC 细胞系的生长速度可能存在较大差异，需要操作人员根据之前经验进行调整。
3.6 接种后剩余的细胞如果需要保留，可以离心去上清后以 2×106/ ml 的密度冻存。
将 PSC 消化成细胞团形态进行传代和冻存对细胞造成的压力较小，适合不需要精确控制细胞接种数量的场景，如日常留种传代。
4.1 室温预热 S8 完全培养基、PBS（不含钙、镁） 、0.5mM EDTA(0 .5M EDTA 和不含钙、镁的 PBS 以 1:1000 比例配制）和 Matrigel 包被的六孔板。将 9ml S8 完全培养基转移至 15ml离心管中。
4.2 吸弃包被完成的六孔板中的 Matrigel ，每孔加入 2ml S8 完全培养基，放入 37℃培养箱中平衡 pH 和温度。
4.3 从培养箱中取出细胞，吸弃培液。每孔加入 1ml PBS ，轻柔晃动孔板以润洗表面一次，吸弃。每孔加入 1ml 0. 5mM EDTA 消化液，置于 37℃培养箱中消化 5-8 分钟。于显微镜下观察，细胞团边缘明显变亮、有脱离迹象时即可终止消化。
-不同 PSC 细胞系的贴壁强度存在差别，需要操作人员观察并优化 。使用其它消化液时
请参照各自品牌提供的操作说明。
4.4 用移液器轻柔吹打 3-4 次使细胞团从六孔板表面脱落，并形成较为均匀的细胞悬液，加入 4.1 准备的 9ml S8 完全培养基中终止消化，离心后去上清，用 1-2ml S8 完全培养基重悬
。
-如果细胞的贴壁力度较强，也可使用细胞刮刀辅助传代。
4.5 根据后续实验计划，在步骤 4.2 准备的六孔板中以 1:5-1:20 的比例接种细胞团，在37℃培养箱中十字法摇晃均匀，24h 后更换新的 S8 完全培养基，此后隔天换液直至细胞融合度达到 80-90% 。各个细胞系的生长速度可能存在较大差异，需要操作人员根据之前经验进行调整。
4.6 接种后剩余的细胞如果需要保留，可以离心去上清后以估算的 100 万/管的密度冻存。
Stem 8 培养基对目前常用的 E8 和 mTesR 培养体系兼容性较好，直接进行传代操作时通常不需要额外的适应阶段，但在从原有体系转移至 Stem 8 体系时需要注意以下几点：
5 . 1 不要同时 改变培养基和包被材料 ， 如原体系是 mTesR+ Matrigel ， 想要过渡至YuanStem 8+VTN ，则应该先在传代时使用 mTesR+VTN 体系，第二天换液时再过渡至 YuanStem 8+VTN 体系；
5.2 不推荐直接用Stem 8 培养基直接复苏其它体系下培养的细胞 ，但如果不得不如此做 , 可以通过适当提高接种密度来提升复苏后的细胞状态；
5.3 不论以单细胞还是细胞团形式传代，体系转换时最好添加凋亡抑制剂。
5.4 如果传代时直接转换培养基，PSC 死亡较严重，可在传代前 2-3 天培养体系更换为Stem 8 培养体系，然后正常传代即可。
容器 | 平时用量（ ml） | 周末用量（ ml） | 接种细胞量（万） | 收获细胞量（万） |
96 孔板 | 0.1 | 0.2 | 1-2 | 10-20 |
24 孔板 | 0.5 | 1 | 2.5-5 | 50-100 |
12 孔板 | 1 | 2 | 5-15 | 100-200 |
6 孔板 | 2 | 4 | 10-30 | 200-400 |
T-25 | 5 | 10 | 25-75 | 500-1000 |
T-75 | 15 | 30 | 75-200 | 1500-3000 |
7. 1 细胞传代/复苏后不贴壁，或贴壁细胞少
细胞不贴壁通常是由于包被材料或培养容器出现问题导致的。请逐个排查以下问题：
-培养容器与所用包被材料是否配套（培养容器 TC/非TC；通常情况下 PSC 培养都会使用 TC 培养容器，但也有如 Stemcell Vitronectin XF 这类要求使用非 TC 培养容器的体系）；
-TC 培养容器是否被紫外线照射过？ 紫外线会破坏 TC 培养容器表面的处理层，使其失去增强细胞贴壁性的能力；
-培养中使用的 PBS 是否与包被材料配套（含/不含 Ca2+ 、Mg2+离子；通常情况下 PSC 培养都会使用不含 Ca2+ 、Mg2+ 离子的 PBS ，但也存在 Laminin521 这类要求使用含 Ca2+ 、Mg2+离子的 PBS 进行稀释的包被材料）；
-包被材料是否因保存不当或过期而失效；
-包被材料的稀释、混合、涂板是否均匀；
-包被容器时是否时间不足；
-包被好的容器是否因保存时间过长或密封不严导致涂层失效或蒸发；
-单细胞传代时和复苏时是否添加了用量合适的 Rock 抑制剂；
-复苏细胞时是否计数并确认细胞活率在 80%以上；
-传代时是否将细胞暴露于消化液中时间过长，或中和消化液所用的培液不足；
* 使用的 Matrigel 质量较差，以细胞团形式传代后第二天，细胞无法贴壁。
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