储存条件：鼠尾裂解液 4℃保存；蛋白酶 K、2×PCR Easy Mix‑20℃避光保存
模板稳定性：消化获得的上清模板‑20℃条件可保存 3 个月
规格：M00301‑100T、M00301‑500T、M00301‑1000T
| 组分名称 | M00301‑100T | M00301‑500T | M00301‑1000T | 储存条件 |
|---|---|---|---|---|
| 鼠尾裂解液 | 10 ml | 25 ml×2 | 25 ml×4 | 4℃ |
| 蛋白酶 K | 1 ml | 1 ml×5 | 1 ml×10 | ‑20℃ |
| 2×PCR Easy Mix | 1 ml | 1 ml×5 | 1 ml×10 | ‑20℃ |
单样本消化液配比：鼠尾裂解液 100 μl + 蛋白酶 K 10 μl，现配现用
样本 EP 管加入 100 μl 新鲜配制消化液，组织需要完全浸没；
55℃水浴 / 金属浴消化 30 min；消化不足可延长至 60 min；
95℃孵育 5 min 彻底灭活蛋白酶 K；
12000 rpm 离心 5 min，吸取上清作为 PCR 模板。
| PCR 反应组分 | 20 μL 体系 | 50 μL 体系 |
|---|---|---|
| 模板（消化上清） | 2 μL | 5 μL |
| Forward Primer(10 μM) | 0.5 μL | 1 μL |
| Reverse Primer(10 μM) | 0.5 μL | 1 μL |
| 2×PCR Easy Mix | 10 μL | 25 μL |
| ddH₂O | 7 μL | 18 μL |
PCR 扩增程序
94℃ 5 min，1 个循环；
94℃ 20 sec；50‑65℃ 30 sec；72℃（1kb/min）；循环 35‑40 次；
72℃终延伸 5 min；4℃保存。
PCR 产物自带溴酚蓝指示剂，直接上样琼脂糖凝胶电泳；产物 3' 端带 A 尾，可直接 T 载体克隆、测序。
| 现象 | 原因 | 解决对策 |
|---|---|---|
| 样本与阳性对照均无扩增条带 | PCR 程序设置错误；引物失效 | 优化退火温度与程序；重新合成引物 |
| 样本无条带，阳性对照正常 | 试剂失活；消化不充分；蛋白酶灭活不完全 | 更换新鲜试剂；延长消化时间；保证 95℃5min 灭活步骤 |
| 大量非特异性杂带 | 退火温度过低；模板 / 引物 / 循环数过高；引物错配；体系室温放置太久 | 提升退火温度；降低模板、引物、循环数；冰上配体系尽快上机；重新设计引物 |
组织消化液必须现配现用；
PCR 反应体系全程冰上配制，配制完成尽快上机；
本品仅限科研实验，不能用于临床诊断。
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苏公网安备32058202012212号
