快速鼠尾基因型鉴定（PCR法）试剂盒

组分名称 M00301-100T M00301-500T M00301-1000T 存储条件鼠尾裂解液 10 ml 25ml×2 25ml×4 4°C 蛋白酶K 1 ml 1 ml×5 1ml×10 -20°C 2×PCR Easy Mix 1ml 1ml×5 1ml×10 -20°C

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组分名称	M00301-100T	M00301-500T	M00301-1000T	存储条件
鼠尾裂解液	10 ml	25ml×2	25ml×4	4°C
蛋白酶K	1 ml	1 ml×5	1ml×10	-20°C
2×PCR Easy Mix	1ml	1ml×5	1ml×10	-20°C

实验方法
1、组织消化
1.1按照小鼠数量配制组织消化液，试剂比例如下：

	单样本
蛋白酶K	10 μl
鼠尾裂解液	100 μl

组织消化液现用现配，充分混匀后使用。
1.2 向每个含有样本的EP管中加入100 μl新鲜组织消化液，55°C水浴/金属浴中消化30分钟。组织消化时，请务必将组织完全浸没于消化液中。消化完成后，组织外观上依然完整，但足量的基因组DNA已经释放，不影响后续的PCR实验。
1.3 将样本置于95°C水浴/金属浴中孵育5分钟以灭活消化液中蛋白酶。12000rpm离心5分钟，取上清作为PCR模板。消化后的上清可于-20°C保存三个月。

2、PCR扩增
2.1 PCR反应体系的配制：
最好于低温环境下（如冰浴中）完成，以保证PCR扩增效率和特异性。

PCR反应组分	20 μl反应体系	50 μl反应体系
模板（消化产物）	2 μl	5 μl
正向引物（10 μM）	0.5 μl	1 μl
反向引物（10 μM）	0.5 μl	1 μl
2×PCR Easy Mix	10 μl	25 μl
ddH2O	7 μl	18 μl

2.2 PCR反应条件：

温度（°C）	时间	循环数
94	5 min	1
94	20 sec	35-40
50-65	30 sec
72	X min (1kb/min)
72	5 min	1
4	--	1

3、琼脂糖凝胶电泳
试剂中含有溴酚蓝染料，PCR产物可以直接点样进行琼脂糖凝胶电泳。另外PCR产物的3’端带有碱基A，可直接克隆至T载体，用于DNA测序。

常见问题及对策分析

常见问题	可能原因	对策
样本组与阳性对照组均无扩增条带	PCR反应条件设置不当	优化PCR反应条件
样本组与阳性对照组均无扩增条带	PCR引物质量问题	重新设计PCR引物
样本组无扩增条带而阳性对照组正常	不当储存或长期储存引起试剂活性丧失	使用新鲜的试剂
	组织消化不够充分	延长55°C消化时间至60min
	蛋白酶未被完全灭活	消化产物在95°C孵育5min
存在非特异性扩增条带	PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高	增加PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度
	PCR引物错配	重新设计PCR引物
	配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久	PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后请尽快进行PCR扩增反应

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