EdU细胞增殖检测试剂盒（红色荧光）

产品简介

细胞内新生RNA的变化是评价细胞活性的重要指标。EU (5-Ethynyl-Uridine)  是一种尿嘧啶核苷 类似物,  能够在细胞RNA转录时期代替尿嘧啶 (U)  掺入新合成的RNA分子中,  然后通过基于 EU 与荧光染料的特异性共轭反应，把荧光集团标记到新合成的含有 EU  的 RNA分子中，这样就可以 进行高效快速的荧光检测RNA的转录活性。本试剂盒将直接测定细胞内新生RNA的变化，病毒复制 等方面的研究。

传统的检测新生RNA的方法为以放射性同位素标记RNA等方法然后进行Southern blot进行检测。 但是这种方法需要放射性同位素标记及后续的复杂操作步骤。利用EU标记新生RNA的检测方法不需  要剧烈的RNA变性，只需温和的细胞固定化和透化处理，能够较好地保护细胞形态、RNA整体结构  及细胞内抗原识别位点，操作步骤更加快速、灵敏和准确，能在细胞和组织水平反映新生RNA转录  活性的状况。该试剂盒只需要简单的操作步骤，适用于荧光显微镜、共聚焦显微镜以及高内涵筛选  仪进行新生RNA的转录活性。

试剂盒组分 

使用前须知

该试剂盒是采用成像检测方法对贴壁细胞进行检测，适用于荧光显微镜、共聚焦显微镜等仪器。 非贴壁细胞可在孵育EU后进行细胞涂片处理，固定后再采用贴壁细胞的染色流程进行检测。

 实验准备：

1 、 盖玻片

2 、 1×PBS（pH7.2-7.6）（用DEPC水配置）

3 、 含0.5% Triton X-100的PBS  （用DEPC水配置）

4 、 甘氨酸溶液（2 mg/ml）（用DEPC水配置）

5 、 培养板或培养皿

实验步骤（以24孔板，HK2贴壁细胞为例）

EU标记

（a）  将细胞完全培养基中按照500：1的比例加入EU溶液，制成2×EU标记培养基；

（b）  提前将2×EU标记培养基预热，然后等体积加入到细胞原有培养基中，获得1×EU溶液， 其中EU的终浓度为500 μM；

注：1）我们不建议替换全部培养基，因为这样可能会影响细胞增殖的速度；

2）配置好的培养基建议现用现配，用量以没过细胞为宜；

（c）  每孔加入300 μl含EU培养基孵育细胞2小时，弃培养基；

注：1） 培养时间取决于细胞的增殖速度和生长状态；

2） 孵育时间最少2小时，可延长至24小时后再检测也可以。

（d）  以1×PBS清洗细胞两次，每次5分钟，以除去未掺入RNA的EU残留。

注： 贴壁不牢的细胞可降低清洗强度。 细胞的固定和通透

（a）  每孔加入150 μl  细胞固定液，室温培养30分钟，弃固定液；

注： 1)  该试剂盒配备了细胞固定液，也可以使用含4%多聚甲醛的PBS来进行细胞固定；

2)  如果使用其他的细胞固定剂最好用DEPC水来配置，避免RNA酶降解细胞内的RNA。 （b）  每孔加入150 μl 2mg/ml  甘氨酸，摇床孵育5分钟；

（c）  弃甘氨酸溶液，每孔加入300 μl PBS洗液，室温清洗5分钟； 

（d）  每孔加入300 μl 0.5% Triton X-100细胞通透液，室温通透10分钟，弃细胞通透溶液； （e）  每孔加入300 μl PBS洗液，室温清洗5分钟；

EU染色

（a）  通过用10：1去离子水稀释10×反应缓冲液进行配制1×EU  反应缓冲液；

（b）  按照溶解 200 mg缓冲添加剂溶于1ml去离子水的比例称取适量的粉末进行溶解，即为 可用的缓冲添加剂的浓度，建议现用现配；

注：缓冲添加剂为白色粉末，较难准确称量，称量范围可稍微放宽，但是不应超过±20% ，且该 粉末较易氧化，使用后请旋紧管盖，如试剂出现棕黄色，则需报废或更换。

（c）  按照以下的表格进行染色反应液的配制：

（d）  每孔加入100 μl  配置好的检测混合液，以覆盖细胞为宜，避光、室温孵育30分钟； （e）  弃染色反应液，加入100 μl 0 .5% Triton X-100细胞渗透液清洗2-3次，每次10分钟； （f）   弃细胞渗透液，用PBS洗两次，每次5分钟。

DNA染色 

（a）  将Hoechst 33342 用RNase-free 水溶液1： 1000 进行稀释得到终浓度为 1×Hoechst染色液；

（b）  每孔加入100 μl 1×Hoechst染色液，室温避光孵育20-30分钟后，弃染色液；

（c）  每孔加入100 μl PBS洗细胞两次，去掉洗液。

图像获取及分析

建议染色完成后立即进行荧光显微镜拍照观察；如果条件限制，请于4°C条件下避光湿润保存3

天之内完成拍照。若为细胞爬片或涂片，可使用抗荧光淬灭封片剂进行封片后于4°C条件下保存及拍 照检测。

案例图示

图注：将 J82 细胞分别不处理和用药物放线菌素 D（阴性对照药物）进行处理之后，通过该公司的 EU 新生 RNA 检测试剂盒检测正常细胞中显示非常强烈的 RNA 信号，而放线菌素 D 处理的细胞中 没有显著的信号。