细胞内新生RNA的变化是评价细胞活性的重要指标。EU (5-Ethynyl-Uridine) 是一种尿嘧啶核苷 类似物, 能够在细胞RNA转录时期代替尿嘧啶 (U)掺入新合成的RNA分子中,然后通过基于 EU 与荧光染料的特异性共轭反应，把荧光集团标记到新合成的含有 EU的 RNA分子中，这样就可以 进行高效快速的荧光检测RNA的转录活性。本试剂盒将直接测定细胞内新生RNA的变化，病毒复制 等方面的研究。
传统的检测新生RNA的方法为以放射性同位素标记RNA等方法然后进行Southern blot进行检测。 但是这种方法需要放射性同位素标记及后续的复杂操作步骤。利用EU标记新生RNA的检测方法不需要剧烈的RNA变性，只需温和的细胞固定化和透化处理，能够较好地保护细胞形态、RNA整体结构及细胞内抗原识别位点，操作步骤更加快速、灵敏和准确，能在细胞和组织水平反映新生RNA转录活性的状况。该试剂盒只需要简单的操作步骤，适用于荧光显微镜、共聚焦显微镜以及高内涵筛选仪进行新生RNA的转录活性。
产品编号 | 试剂 | 浓度 | 试剂量 |
JX0906 | 细胞固定液 | 1× | 15 ml |
EU溶液 | 1000× | 40 μl | |
反应缓冲液 | 10× | 1 ml | |
催化剂溶液 | 25× | 400 μl | |
TAMRA红色荧光溶液 | 400× | 25 μl | |
缓冲添加剂 | 粉末 | 200 mg | |
Hoechst 33342 | 1000× | 20 μl |
该试剂盒是采用成像检测方法对贴壁细胞进行检测，适用于荧光显微镜、共聚焦显微镜等仪器。 非贴壁细胞可在孵育EU后进行细胞涂片处理，固定后再采用贴壁细胞的染色流程进行检测。
1 、 盖玻片
2 、 1×PBS（pH7.2-7.6）（用DEPC水配置）
3 、 含0.5% Triton X-100的PBS（用DEPC水配置）
4 、 甘氨酸溶液（2 mg/ml）（用DEPC水配置）
5 、 培养板或培养皿
EU标记
（a）将细胞完全培养基中按照500：1的比例加入EU溶液，制成2×EU标记培养基；
（b）提前将2×EU标记培养基预热，然后等体积加入到细胞原有培养基中，获得1×EU溶液， 其中EU的终浓度为500 μM；
注：1）我们不建议替换全部培养基，因为这样可能会影响细胞增殖的速度；
2）配置好的培养基建议现用现配，用量以没过细胞为宜；
（c）每孔加入300 μl含EU培养基孵育细胞2小时，弃培养基；
注：1） 培养时间取决于细胞的增殖速度和生长状态；
2） 孵育时间最少2小时，可延长至24小时后再检测也可以。
（d）以1×PBS清洗细胞两次，每次5分钟，以除去未掺入RNA的EU残留。
注： 贴壁不牢的细胞可降低清洗强度。 细胞的固定和通透
（a）每孔加入150 μl 细胞固定液，室温培养30分钟，弃固定液；
注： 1) 该试剂盒配备了细胞固定液，也可以使用含4%多聚甲醛的PBS来进行细胞固定；
2) 如果使用其他的细胞固定剂最好用DEPC水来配置，避免RNA酶降解细胞内的RNA。 （b）每孔加入150 μl 2mg/ml甘氨酸，摇床孵育5分钟；
（c）弃甘氨酸溶液，每孔加入300 μl PBS洗液，室温清洗5分钟；
（d）每孔加入300 μl 0.5% Triton X-100细胞通透液，室温通透10分钟，弃细胞通透溶液； （e）每孔加入300 μl PBS洗液，室温清洗5分钟；
EU染色
（a）通过用10：1去离子水稀释10×反应缓冲液进行配制1×EU反应缓冲液；
（b）按照溶解 200 mg缓冲添加剂溶于1ml去离子水的比例称取适量的粉末进行溶解，即为 可用的缓冲添加剂的浓度，建议现用现配；
注：缓冲添加剂为白色粉末，较难准确称量，称量范围可稍微放宽，但是不应超过±20% ，且该 粉末较易氧化，使用后请旋紧管盖，如试剂出现棕黄色，则需报废或更换。
（c）按照以下的表格进行染色反应液的配制：
染色反应液组分 | 500 μl | 1 ml | 2 ml | 5 ml |
1×反应缓冲液 | 430 μl | 860 μl | 1.8 ml | 4.3 ml |
催化剂溶液 | 20 μl | 40 μl | 80 μl | 200 μl |
TAMRA红色荧光溶液 | 1.2 μl | 2.5 μl | 5 μl | 12.5 μl |
缓冲添加剂 | 50 μl | 100 μl | 200 μl | 500 μl |
（d）每孔加入100 μl 配置好的检测混合液，以覆盖细胞为宜，避光、室温孵育30分钟； （e）弃染色反应液，加入100 μl 0 .5% Triton X-100细胞渗透液清洗2-3次，每次10分钟； （f）弃细胞渗透液，用PBS洗两次，每次5分钟。
DNA染色
（a） 将Hoechst 33342 用RNase-free 水溶液1： 1000 进行稀释得到终浓度为 1×Hoechst染色液；
（b） 每孔加入100 μl 1×Hoechst染色液，室温避光孵育20-30分钟后，弃染色液；
（c） 每孔加入100 μl PBS洗细胞两次，去掉洗液。
建议染色完成后立即进行荧光显微镜拍照观察；如果条件限制，请于4°C条件下避光湿润保存3
天之内完成拍照。若为细胞爬片或涂片，可使用抗荧光淬灭封片剂进行封片后于4°C条件下保存及拍 照检测。
荧光染料 | 最大激发波长 | 最大发射波长 | 荧光颜色 |
TAMRA | 541 nm | 567 nm | 橘红色荧光 |
Hoechst 33342 | 350 nm | 461 nm | 蓝色荧光 |
图注：将 J82 细胞分别不处理和用药物放线菌素 D（阴性对照药物）进行处理之后，通过该公司的 EU 新生 RNA 检测试剂盒检测正常细胞中显示非常强烈的 RNA 信号，而放线菌素 D 处理的细胞中 没有显著的信号。
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